Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) επιμέλεια: Μιχάλης Χαλικιόπουλος καθηγητής Βιολογίας

Transcript

1 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) επιμέλεια: Μιχάλης Χαλικιόπουλος καθηγητής Βιολογίας 1

2 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA 2

3 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) 3

4 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ορισμός: Κλωνοποίηση είναι η παραγωγή πολλών αντιγράφων ενός οργανισμού ενός κυττάρου ή ενός γονιδίου μετά από επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής. χρήση: (σελ. 61) Η δημιουργία πολλών αντιγράφων είναι απαραίτητη προϋπόθεση τόσο o για τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου όσο και o για την παραγωγή της πρωτεΐνης που αυτό κωδικοποιεί λίγο πιο καθαρά! ΣΤΑΔΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ - ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ & ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Η κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA. Για το σκοπό αυτό το ολικό DNA από έναν οργανισμό δότη o απομονώνεται, o κόβεται ενζυματικά με ειδικά ένζυμα, τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, και o ενώνεται με ένα φορέα κλωνοποίησης. Η μεταφορά του ανασυνδυασμένου μορίου DNA σε ένα κύτταρο-ξενιστή. Η εισαγωγή του DNA σε βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή ονομάζεται μετασχηματισμός. Η επιλογή και απομόνωση των κυττάρων-ξενιστών. o Στο στάδιο αυτό τα κύτταρα-ξενιστές που έχουν προσλάβει το ανασυνδυασμένο DNA επιλέγονται από εκείνα που δεν το έχουν προσλάβει. o Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ένα μόνο μόριο ανασυνδυασμένου DNA πολλαπλασιάζεται και παράγει μια αποικία που αποτελεί ένα βακτηριακό κλώνο. Είναι φανερό ότι με την παραπάνω διαδικασία παράγονται χιλιάδες κλώνοι, που ο καθένας περιέχει ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA διαφορετικό από τους υπόλοιπους κλώνους. Η επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA. Αυτή πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών μορίων ανιχνευτών. 4

5 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) 1 ΦΟΡΕΑΣ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ Τι είναι: Είναι ένα μόριο DNA, π.χ. πλασμίδιο ή DNA φάγων, το οποίο μπορεί να αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή όπως ένα βακτήριο. To DNA που δημιουργείται είναι ανασυνδυασμένο Τι κάνει: o Σε αυτό ενσωματώνονται τα τμήματα DNA του οργανισμού δότη. o Με τη βοήθεια τους τα τμήματα DNA μεταφέρονται στο εσωτερικό των κυττάρων - ξενιστών. o Οι φορείς κλωνοποίησης έχουν την ικανότητα να αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα στο εσωτερικό των κυττάρωνξενιστών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγάλου αριθμού πανομοιότυπων αντιγράφων των τμημάτων DNA που φέρουν. Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά: Τα πλασμίδια Τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης πρέπει να πληρούν δύο προϋποθέσεις: α. Να διαθέτουν μόνο μία θέση αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση. β. Να διαθέτουν τουλάχιστον ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό, στο οποίο να μην περιλαμβάνεται η θέση αναγνώρισης για την περιοριστική ενδονουκλεάση. Η κλωνοποίηση σε πλασμίδια είναι σχετικά απλή. Για το λόγο αυτό τα πλασμίδια αποτελούν το συνηθέστερο φορέα κλωνοποίησης για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα. Βακτηριοφάγος λ Στο DNA του φάγου αυτού ενσωματώνονται μεγάλα κομμάτια ξένου DNA. 2 ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ σελ. 59 Βακτήρια - ξενιστές δέχονται σε μικρό ποσοστό πλασμίδια, μερικά από τα οποία είναι ανασυνδυασμένα. Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές, βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και επομένως είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά (βλ. σελ. 18 σχολικό). Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια, μετά από κατάλληλη κατεργασία (μετασχηματισμός). 5

6 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA 3 ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ 1 Απομόνωση DNA A 2 B ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ΜΟΡΙΟΥ DNA Ορισμός γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 8 6

7 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) Σχηματική παράσταση σταδίων παραγωγής ανασυνδυασμένου μορίου DNA και κλωνοποίησή του. 7

8 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Εικόνα 4.4 8

9 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) 3 ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ 1. ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ Σελίδα 59 4 ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ΜΟΡΙΟΥ DNA 9

10 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA 10

11 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) υβριδοποίηση ανιχνευτές 11

12 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA 12

13 Θεωρία (4 Ο Κεφάλαιο) ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕ cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη Στο σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιλαμβάνονται αντίγραφα όλου του DNA του οργανισμού-δότη. Στους κλώνους βακτηρίων που περιέχουν γονίδια υπάρχουν και τα εσώνια. Ο αριθμός των κλώνων είναι πολύ μεγάλος. Κύριος σκοπός της κατασκευής της είναι η μελέτη αλληλουχιών του γονιδιώματος διάφορων οργανισμών, ακόμη και αυτών που δεν αποτελούν γονίδια. cdna βιβλιοθήκη Στο σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιλαμβάνονται αντίγραφα μόνο των γονιδίων που μεταγράφονται σε ορισμένο τύπο κυττάρων. Τα κλωνοποιημένα γονίδια δεν φέρουν εσώνια. Ο αριθμός των κλώνων είναι μικρός και σχετίζεται με τον αριθμό των γονιδίων και το ρυθμό με τον οποίο εκφράζονται στο επιλεγμένο κύτταρο. Κύριος σκοπός της κατασκευής της είναι η σύνθεση πρωτεϊνών και η μελέτη των αλληλουχιών που εκφράζονται σε συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη Από τον οργανισμό απομονώνεται DNA. Η τεχνική της αποδιάταξης χρησιμοποιείται κατά την επιλογή ενός κλώνου. Χρησιμοποιούνται τα ένζυμα o περιοριστική ενδονουκλεάση και o DNA δεσμάση. Το DNA του δότη όσο και ο φορέας κλωνοποίησης τέμνονται από την περιοριστική ενδονουκλεάση. cdna βιβλιοθήκη Από τον οργανισμό απομονώνεται RNA, το οποίο in vitro χρησιμοποιείται για τη σύνθεση DNA. Η τεχνική της αποδιάταξης χρησιμοποιείται τόσο για τον αποχωρισμό του cdna από το RNA όσο και για την επιλογή του επιθυμητού κλώνου. Χρησιμοποιούνται τα ένζυμα o αντίστροφη μεταγραφάση, o DNA πολυμεράση, o περιοριστική ενδονουκλεάση και o DNA δεσμάση. Μόνο ο φορέας κλωνοποίησης τέμνεται από την περιοριστική ενδονουκλεάση. 13

14 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA 14